KULTUR JARINGAN TANAMAN : STERILISASI PERALATAN

LAPORAN PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN TANAMAN

ACARA I

STERILISASI PERALATAN

I.       PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan suatu usaha untuk pengembangan tanaman secara vegetatif         yang dapat mengembangkan tanaman dalam jumlah yang besar dalam waktu          yang relatif singkat. Pengertian kultur jaringan sendiri adalah usaha untuk mengisolasi, menumbuhkan dan meregenerasi protoplas, sel, jaringan dan organ tanaman dalam keadaan aseptis di dalam media yang kaya nutrisi. Teknik kultur jaringan akan berhasil bilamana memenuhi persyaratan dalam kultur jaringan yaitu media yang cocok, kondisi lngkungan yang sesuai dan dalam kondisi aspetis atau steril.

Dari persyaratan tersebut maka diperlukan sterilisasi dalam melakukan kegiatan kultur jaringan. Menurut Moeso Suryowinoto (2000) Berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung pada keadaan aseptic atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang meliputi eksplan (bagian tanaman yang akan dikultur), peralatan yang digunakan, pekerja yang melakukan kultur maupun ruangan yang digunakan untuk kultur jaringan.

Sterilisasi peralatan yang terbuat dari gelas seperti erlenmeyer, test tube, petridish disterilkan dengan autoclave. Sebelum digunakan peralatan dicuci dan disikat dengan detergen kemudian dibilas air tawar, tunggu kering, setelah itu ditutup rapat dengan alumunium foil dan plastik Setelah itu diatur rapi dalam autoclave, autoclave ditutup rapat dan dioperasikan pada suhu 121˚C dengan tekanan 1 atm, selama 30 menit (Sari dan Abdul, 2012).

Widarto (2000) mengatakan bahwa banyak peralatan yang digunakan dalam sistem kultur jaringan, tetapi pada dasarnya dikelompokan menjadi dua golongan yaitu:

1.     Peralatan ringan, meliputi pinset, pisau, gelas ukur, gelas piala, erlemeyer, botol media, petridish, pipet, gunting, corong, panic, kompor gas, dll

2.     Peralatan berat, meliputi mesin penggojok, LAF (Laminar Air Flow), timbangan listrik atau analitik, mesin distilator, oven, mikroskop, pH meter, pendingin ruangan, autoclave dan entkas.

Sterilisasi alat harus dilakukan dalam percobaan kultur jaringan untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang dapat merusak kelangsungan percobaan yang dilakukan dilaboratorium. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, cara tersebut meliputi sterilisasi secara mekanik, kimia, maupun sterilisasi secara fisik.

Berdasarkan pemaparan tersebut, dapat diketahui bahwa sterilisasi sangatlah penting dalam kegiatan perkembangbiakan secara in vitro atau melalu kultur jaringan. Hal tersebutlah yang mendasari mengapa praktikum sterilisasi peralatan ini dilakukan.

B.     Tujuan Praktikum

Tujuan dari Praktikum Kultur Jaringan Tanaman Acara Sterilisasi Peralatan adalah meningkatkan ketrampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan autoklaf.

II.    METODE PELAKSANAAN

A.    Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Praktikum Kultur Jaringan Tanaman Acara Sterilisasi Peralatan dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 28 November 2013 pukul 14.00 WIB Bertempat di Laboratorium Agronomi Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.

A.    Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum Kultur Jaringan Tanaman Acara Sterilisasi Peralatan antara lain: detergen/ sabun dan air bersih.

B.    Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum Kultur Jaringan Tanaman Acara Sterilisasi Peralatan antara lain: glass ware terdiri dari botol kultur, erlenmeyer dan petridish, dissecting kit terdiri dari scalpel dan pinset, autoklaf, aluminium foil, karet gelang, kompor, serta kertas payung/ pembungkus.

C.    Prosedur Kerja

1.      Glass ware dan dissecting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu dikeringkan.

2.      Setelah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil, untuk pinset dan scalpel dibungkus dengan kertas payung.

3.      Glass ware dan dissecting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C  dan tekanan 17,5 psi selama 30 menit.

4.      Selama sterilisasi autoklaf ditutup rapat sehingga tekanan di dalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, selanjutnya katup dibuka untuk membuang uap air sehingga tekanan akan turun hingga ke tekanan 0 psi dan dilakukan sampai tiga kali.

5.      Autoklaf dibuka dan peralatan yang sudah disterilisasi dikeluarkan. Peralatan yang sudah disterilkan disimpan di tempat yang bersih.

III.   PEMBAHASAN

Syarat utama dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang aseptis atau steril untuk semua komponen dalam kultur jaringan. Kegiatan kultur diawali dengan sterilisasi alat dan bahan. Sterilisasi alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan suatu alat atau bahan yang bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan seperti jamur dan bakteri. Alat- alat yang digunakan yaitu botol kultur, cawan petri, erlenmeyer, batang pengaduk, gelas piala, pipet serta peralatan glass ware lainnya harus bersih dan steril. Sterilisasi alat yang dilakukan pada praktikum ini adalah menggunakan autoclave. Alat-alat yang di sterilisasi yaitu peralatan yang berupa glass ware dan dissecting kit. glass ware dan dissecting kit ini di sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 120˚ C dengan tekanan 17,5 psi selama 30 menit karena pada tekanan ini bakteri dan jamur yang terdapat dalam peralatan akan mati.

Tidak hanya glass ware dan dissecting kit saja yang digunakan pada praktikum kultur jaringan. Berikut adalah peralatan yang akan digunakan pada praktikum kultur jaringan beserta fungsinya.

1.      Autoclave

Autoclave merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi alat dan media kultur jaringan, peralatan yang biasa di sterilisasi menggunakan autoclave adalah glass ware dan dissecting kit.  Gabriel (1988) mengemukakan bahwa autoclave merupakan alat yang mampu mensterilkan bermacam- macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi yakni  menggunakan uap air yang bertekanan panas. Jadi autoclave adalah alat yang digunakan untuk mensterilkan alat atau bahan- bahan yang dalam hal ini dugunakan pada teknik kultur jaringan. Autoclave bekerja berdasarkan prinsip tekanan panas uap air. Beberapa mikroba akan mati apabila berada pada kondisi lingkungan panas tinggi, tetapi ada pula mikroba yang masih bisa hidup pada kondisi lingkungan yang ekstrim seperti mampu hidup di lingkungan yang suhunya tinggi. Autoclave digunakan pada tekanan 17,5 psi dan suhu 120°C.

                          

Gambar 1. Autoclave                           Gambar 2. Laminair Air Flow

2.      Laminar Air Flow (LAF)

Laminar Air Flow (LAF) merupakan lemari yang digunakan sebagai tempat ketika akan melakukan penanaman eksplan dalam kultur jaringan. Menurut Sriyanti dan Ari Wijayani (2012) prinsip kerja dari laminar air flow ini adalah dengan mengalirkan arus udara yang laminair ke dalam almari penabur melalui saringan yang besar dengan ukuran mesh 0,22-0,24 mikron. Bakteri dan jamur ditahan oleh saringan ini, sehingga udara yang masuk kedalam laminar air flow sudah steril dan membuat ruangan menjadi steril pula.

Sama seperti peralatan yang lainnya, laminar air flow pun harus melalui tahap sterilisasi. Laminar air flow terlebih dahulu disemprot dengan alkohol 70 % di bagian dalamnya. Setelah sterilisasi dengan alkohol, pintu laminar air flow ditutup dan lampu ultraviolet (UV) dinyalakan selama ½ sampai 1 jam. Setelah sterilisasi dengan lampu ultraviolet (UV)  pekerjaan dapat segera dimulai.

3.      Botol Kultur

Botol kultur digunakan sebagai tempat media yang digunkanan untuk menanam eksplan. Botol kultur ini harus dicuci hingga bersih terlebih dahulu menggunakan detergen. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel pada dinding botol guna menghindari kontaminasi.

                                

Gambar 3. Botol kultur        Gambar 4. Gelas piala          Gambar 5. Gelas ukur

4.      Gelas Piala

Gelas piala merupakan wadah yang terbuat dari borosilikat. Gelas piala yang digunakan untuk bahan kimia yang bersifat korosif terbuat dari PTPE. Fungsi gelas piala pada kultur jaringan adalah untuk mengaduk, mencampur dan memanaskan larutan yang akan digunkan untuk pembuatan media.

5.      Gelas ukur

Gelas ukur adalah gelas berbentuk tabung dengan skala pada dindingnya. Pada praktikum ini gelas ukur digunakan untuk mengukur jumlah larutan yang akan digunakan dalam jumlah cukup banyak seperti akuades.  Gelas ukur termasuk dalam glass ware, ukuran volume gelas ukur bermacam-macam misalnya : 100 ml, 300 ml sampai 1000 ml. Gelas ukur biasanya jarang disterilkan karena penggunaannya hanya untuk pembuatan medium saja.                                  

6.      Botol Erlenmeyer

Botol erlemeyer adalah botol berdasar lebar, botol ini terbuat dari kaca bening yang tahan panas. Erlemeyer pada kultur jaringan dipergunakan untuk tempat dan sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan. Ukuran erlemeyer bermacam-macam dari volume 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml, sampai 2 liter.

                       

Gambar 6. Erlenmeyer      Gambar 7. Cawan petri           Gambar 8. Bunsen

7.      Cawan Petri

Cawan petri atau petridish adalah jenis gelas piala yang dibutuhkan dalam kultur jaringan untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media. Cawan petri biasanya disterilisasi bersama dengan kertas saring di dalamnya tetapi sebelumnya cawan petri ini harus dicuci bersih kemudian dikeringkan dan setelah kering dibungkus dengan kertas payung coklat untuk disterilisasi dengan autoclave.

8.      Bunsen

Lampu spirtus atau bunsen digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (scalpel dan pinset) di dalam laminar air flow pada saat penanaman atau sub-culture. Sterilisasi dengan menggunakan bunsen ini dengan cara mencelupkan dissecting kit kedalam alkohol kemudian dibakar diatas api bunsen.

9.      Pipet Tetes

Pipet tetes (drop pipette) berfungsi membantu memindahkan cairan dari wadah yang satu ke wadah yang lain dalam jumlah yang sangat kecil tetes demi tetes. Pipet tetes ini memiliki ketelitian yang kurang dalam memindahkan larutan karena hanya dapat digunakan dengan perkiraan.

        

    Gambar 9. Pipet tetes          Gambar 10. Pinset              Gambar 11. Scalpel

10.  Pinset

Dalam kultur jaringan pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan. Teknik penanaman eksplan harus diusahakan agar ujung pinset tidak mengenai media supaya tidak terkontaminasi.

11.  Scalpel

Scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau memotong eksplan. Scalpel ini termasuk dalam peralatan yang masuk kategori dissecting kit. Sebelum digunkan scalpel harus disterilisasi di dalam autoclave dan dengan di flamir yaitu scalpel dicelupkan dalam alkohol kemudian dibakar di atas api bunsen.

12.  Alumunium Foil dan Seal

Alumunium foil digunakan sebagai penutup botol kultur. Aluminium foil dipotong persegi dan ukuran potongan aluminium foil dibuat sedemikian rupa sehingga aluminium foil tersebut menutupi bagian terbuka dari botol kultur sampai 2 inchi ke bawah pada tepi botol kultur atau wadah lainnya. Dan untuk lebih merapatkan penutupan dapat dipakai seal. Aluminium foil ini tahan panas sehingga saat dipanaskan dalam autoclave pun tidak masalah.

                                

Gambar 12. Alumunium foil                           Gambar 13. Seal

13.  Magnetik Stirrer dan Hot Plate

Magnetic stirrer digunakan untuk menghomogenkan larutan media yang akan dibuat nantinya. Magnet pengaduk ini nantinya akan berputar pada dasar botol dimana magnet akan menempel karena adanya gaya tarik menarik magnet. Kecepatan putaran dapat diatur sesuai keinginan. Ada beberapa jenis magnetic stirrer yang dilengkapi dengan hot plate yang bisa digunakan untuk memanaskan.

                          

Gambar 14. Hot plate                 Gmabar 15. Magnetic Strirrer

14.  Hand Sprayer

Hand sprayer digunakan untuk menyemprotkan alkohol untuk sterilitasi laminar air flow dan tangan serta alat-alat yang akan dimasukkan ke dalam laminar air flow.

                 

Gambar 16. Hand sprayer          Gambar 17. pH meter elektrik

15.  pH Meter Elektrik

pH meter digunakan untuk mengetahui nilai atau tingkat kemasaman suatu jenis bahan. pH meter sangat diperlukan karena dalam pembuatan media, ada parameter tingkat kemasaman yang harus dipenuhi yaitu diantara 5,7- 5,8. Cara menggunakan pH meter yaitu, sensor pada pH meter dicelupkan kedalam larutan yang akan dibuat menjadi media, nantinya akan muncul angka pada layar yang menunjukkan nilai kemasaman larutan tersebut.

16.  Kertas Payung

Kertas payung berguna untuk membungkus peralatan seperti dissecting kit saat di sterilisasi di dalam autoclave.

                      

 Gambar 18. Spatula           Gambar 19. Corong                    Gambar 20. Tisu

Selain peralatan-peralatan tersebut ada pula peralatan-peralatan lain yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan, seperti spatula untuk mengaduk larutan secara manual saat pembuatan media, corong untuk memasukkan larutan agar tidak meluber, rak kultur untuk menempatkan botol kultur baik setelah sterilisasi maupun yang sudah berisi media dan eksplan, tisu untuk membersihkan atau mengelap botol yang basah, serta  sarung tangan untuk membungkus tangan dan masker yang digunakan untuk menutupi mulut agar tidak terjadi kontaminasi pada media maupun eksplan yang ditanam.

IV.  PENUTUP

A.    Kesimpulan

Setelah melakukan praktikum Acara Sterilisasi Peralatan dapat disimpulkan bahwa:

1.      Telah dapat dilakukan tahapan sterilisasi peralatan menggunakan autoclave.

2.      Alat- alat yang disterilkan dengan autoclave adalah botol kultur, erlenmayer, petridish, gelas piala, pipet tetes serta batang pengaduk.

B.     Saran

1.      Harus berhati-hati dalam melakukan sterilisasi menggunakan autoclave apalagi yang di sterilisasi adalah peralatan yang terbuat dari kaca

2.      Setelah peralatan disterilisasi sebaiknya ditempatkan pada tempat yang steril, tidak hanya tempat yang bersih saja.

DAFTAR PUSTAKA

Gabriel, J. F., 1988. Fisika Kedokteran. EGC. Jakarta.

Sari, I. P., dan Abdul Manan. 2012. “Pola Pertumbuhan Nannochloropsis Oculata pada Kultur Skala Laboratorium, Intermediet, dan Massal”. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol. 4(2):123-127.

Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2012. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.

Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius, Yogyakarta.

Widarto, L. 2000. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung, Okulasi dan Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta.

Related Posts:

Tweet